Funktionelle Untersuchungen und Festkörper-NMR-Strukturanalyse am Fusionspeptid des HIV-1Dorit Grasnick
Taschenbuch
Im Rahmen dieser Arbeit sollte aus den Ergebnissen von verschiedenen Festkörper-N M R-Messungen ein Strukturmodell des F P23 in der Membran der Zielzelle erstellt werden und daraus resultierende Hinweise für den Fusionsmechanismus abgeleitet werden. Hierfür wurden der Wildtyp, sowie mehrere - mit unnatürlichen Aminosäuren als N M R-Sonden - an geeigneter Position markierte Varianten des Fusionspeptids ( F P23) des Proteins gp41 aus H I V-1 mit 23 Aminosäureresten mittels Festphasenpeptidsynthese in ausreichender Menge und Reinheit hergestellt. Diese wurden mittels R P-H P L C charakterisiert und aufgereinigt, sowie die bei der Synthese erhaltenen Peptidepimere voneinander getrennt. Die absolute Konfiguration der Peptidepimere wurde mittels stereospezifischer enzymatischer Umsetzung des razemischen 4-C F3-Phenylglycins, saurer Hydrolyse der Peptidepimere und anschließender Derivatisierung mit Marfeys Reagenz erstmals eindeutig bestimmt. Die strukturellen Eigenschaften der Peptide in Lösung wurden mittels C D Spektroskopie untersucht. Eine Störung der Peptidstruktur durch den Einbau von 4-C F3-Phg wurde nicht nachgewiesen. Die fusogene Aktivität der Peptide wurde mittels eines Lipid-Mixing-Assays an Lipidvesikeln, basierend auf Fluoreszenz- Resonanz-Energie-Transfer, überprüft. Mit Hilfe einer alternativen Methode, der dynamischen Lichtstreuung, wurde die fusogene Aktivität der Peptide bestätigt. Eingehende strukturelle Untersuchungen der Peptide in orientierten Lipidbilayern, welche die Zellmembran der Viruszielzelle imitieren, wurden mittels 31 P-, 2 H- und 19 F-Festkörper-N M R-Messungen in orientierten Membranen durchgeführt. Mit den hierbei gewonnenen Informationen wurde mit zwei verschiedenen Methoden eine Analyse der Sekundärstruktur des F P23 in Lipidbilayern durchgeführt. Daraus wurde ein Strukturmodell des F P23 in einer Lipiddoppelschicht erstellt.
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